رضوان كالپوش

1ـ تأثير اندك شرايط محيطي و آب و هوايي بر پرورش قارچ خوراكي: 

قارچ خوراكي در بيشتر مناطق آب و هوايي كشور بدون تجهيزات و امكانات ويژه قابل پرورش است. زيرا توليد و پرورش آن در مكان‌هاي كنترل شده و سربسته صورت مي‌گيرد. همچنين پرورش قارچ از لحاظ صرفه‌جويي در استفاده از زمين، قابل توجه مي‌باشد. 

2ـ صرفه اقتصادي: 
براي توليد و پرورش قارچ خوراكي از بقاياي گياهي محصولات كشاورزي از قبيل كاه و كلش و ساير مواد زايد گياهي استفاده مي‌شود و نيز كمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، مي‌تواند به عنوان كود آلي مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گيرد. از سوي ديگر تهية منابع پروتئيني ديگر، در مقايسه با قارچ، هزينه بشتري دارد. 
3ـ ارزش غذايي: 
قارچ خوراكي با ميزان پروتئين 30ـ25 درصدي هم‌رديف حبوبات و بالاتر از سبزيجات و ميوه‌ها قرار دارد. همچنين هضم 80ـ70 درصدي پروتئين قارچ حائز اهميت است و ميزان كربوهيدرات‌ها و كلسترول در آن پايين است. به دليلي پايين بودن كالري در قارچ يك رژيم غذايي مناسب براي لاغري است. قارچ‌هاي خوراكي داراي تركيبات ضدسرطان نيز مي‌باشند. با مصرف قارچ‌هاي خوراكي مي‌توان ويتامين‌هاي C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدني مانند پتاسيم، كلسيم، فسفر و مقاديري آهن مورد نياز بدن را تأمين كرد. برخي از اسيدهاي آمينه در قارچ‌ خوراكي شامل ليزين، تريپتوفان، تريپسين و اسيد فوليك مي‌باشد (محمدي گل تپه، 1379). 

همچنين مقايسه برخي از اسيدآمينه‌هاي موجود در قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد با تخم‌مرغ، كه يك منبع غذايي غني از پروتئين مي‌باشد، در جدول 2 آمده است (چنگ و مايلز، 1989) .


جدول 1ـ ارزش غذايي قارچ خوراكي تازه به شرح جدول زير مي‌باشد (غلامعلي پيوست، 1375).

درصـد    مـاده

5/90ـ3/78    آب

30ـ25    پروتئين (وزن خشك)

5/3    پروتئين (وزن تر)

8ـ7/1    چربي (وزن خشك)

3/0ـ2/0    چربي (وزن تر)

1ـ8/0    نمكهاي معدني

12ـ7/7    خاكستر (وزن خشك)

368ـ328    انرژي (k cal در 100 گرم)

 جدول 2ـ مقايسه برخي از اسيدهاي آمينه موجود در قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد با تخم‌مرغ:  (در 100 گرم پروتئين)

قارچ تكمه‌اي سفيد    تخم‌مرغ    اسيد آمينه

5/7    8/8    لوسين

5/4    6/6    ايزولوسين

5/2    3/7    والين

2    6/1    تريپتوفان

1/9    4/6    ليزين

2/4    8/5    فنيل آلانين

9/0    1/3    متيونين

4ـ اشتغال‌زايي: 

چنانچه در زمينه ترويج، توسعه و حمايت از پرورش قارچ خوراكي در مناطق مختلف كشور بخصوص روستاها فعاليت شود، مي‌توان علاوه بر تأمين مواد غذايي گام مؤثري در جهت ايجاد اشتغال جنبي مناسب و افزايش درآمد كشاورزان برداشت. 

در بين قارچهاي خوراكي، قارچ تكمه‌اي سفيد رايج‌ترين قارچي است كه در سراسر جهان كشت مي‌شود. پرورش قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در اواسط قرن هفدهم ميلادي در فرانسه شروع شده و از دهة 1960 توليد آن به صورت صنعت بزرگي، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد 38 درصد كل توليد قارچ خوراكي در دنيا را، به خود اختصاص داده است 

(دفتر امور  گل و گياهان زينتي و قارچ‌هاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382). 

عليرغم اهميت اقتصادي و تجاري قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، برنامه اصلاحي براي بهبود عملكرد آن، با مشكلاتي همراه است. يكي از مهم‌ترين مشكلات، به چرخه نامعمول زندگي اين قارچ برمي‌گردد كه غالباً بجاي تشكيل بازيديوسپورهاي تك هسته‌‌اي،  بازيديوسپورهايي حاوي دو هسته هاپلوئيد متفاوت و سازگار از نظر جنسي، توليد مي‌كند (استوپ و مايبروك، 1999) . مشكل ديگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژيكي قابل مشاهده، بين ميسليوم‌هاي با منشأ تك اسپوري و چند اسپوري مي‌باشد (كريگان، 1992) .  همچنين از نظر تندش اسپور، كه به عنوان اولين گام در يك برنامه اصلاحي است، بسيار ضعيف و ناهماهنگ است (چنگ و مايلز، 1989) . از دهة 1970 ميلادي، الگوي جنسي و چرخه كامل زندگي اين قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در دنيا، در حدود 5/2 كيلوگرم است در حالي كه اين ميزان در ايران، تنها 160 گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در ايالات متحد امريكا حدود يك كيلوگرم مي‌باشد. ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در آلمان، در سال 1959، حدود 5100 تن و در سال 1965، حدود 9000 تن و در سال 1967، به مرز 15000 تن رسيد در سال 1969 ارزش نقدي توليد جهاني اين قارچ از مرز يك ميليارد مارك گذشته بود (غلامعلي پيوست، 1375).

ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي در ايران، در حدود12 هزار تن است كه از اين ميزان، حدود 10 هزار تن به قارچ تكمه‌اي سفيد اختصاص دارد. حدود صد واحد توليدي فعال و نيمه فعال قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، در ايران شناسايي شده‌اند. گرچه آمار و ارقام دقيق و قابل اعتمادي از ميزان عملكرد قارچ خوراكي در ايران در دست نيست، ولي براساس شواهد موجود، عملكرد در ايران، حدود 12 كيلوگرم در مترمربع است، در حاليكه متوسط عملكرد جهاني قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، در حدود 25 كيلوگرم در مترمربع مي‌باشد (دفتر امور گل و گياهان زينتي و قارچهاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382). 

طبق آمار موجود، كشورهاي توليدكننده قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در جدول 3و4  آمده‌اند. 

جدول 3ـ كشورهاي توليد كننده قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در سال 1984

توليد قارچ تكمه‌اي سفيد (هزار تن)    كشور

875    اروپا

425    آمريكاي شمالي

330    چين

68    آسيا

51    آمريكاي لاتين


جدول 4ـ كشورهاي توليد كننده قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در سال 1997

توليد قارچ تكمه‌اي سفيد (هزار تن)    كشور

246    ايالات متحده آمريكا

160    فرانسه

140    چين

90    هلند

84    انگلستان

به علت نبود مراكز تحقيقاتي در ايران و عدم توجه كافي مراكز علمي و دانشگاهي كشور به اين تكنولوژي سودآور و پرمنفعت، پرورش قارچ خوراكي نتوانسته جايگاه واقعي خود را پيدا كند علاوه بر اين بي‌توجهي مراكز تحقيقات كشاورزي موجب عدم تربيت نيروي متخصص لازم و كافي براي پرورش و توليد قارچ خوراكي شده است. 


دلايل عمده عملكرد پايين قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد در ايران: 

1ـ عدم تهيه يك بستر كشت مناسب 

تهيه و آماده‌سازي بستر كشت، (كمپوست) از مهم‌ترين مراحل پرورش قارچ خوراكي است، زيرا تغذيه قارچ خوراكي از بستر كشت تأمين مي‌شود و قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، يك تجزيه كننده ثانويه مي‌باشد و از اجساد ميكروارگانيسم‌هاي موجود در كمپوست نيز استفاده مي‌كند. 

2ـ عدم رعايت بهداشت محيط 

3ـ عدم كنترل دقيق شرايط محيطي، در زمان پرورش قارچ

4ـ ضعف بنيه نژادي 

استفاده پياپي و تكثير رويشي اسپاون با همان روشهاي قديمي، منجر به ضعيف شدن قدرت رويشي اسپاون و كاهش شديد عملكرد آن، شده است. اسپاون وارداتي با زير كشت‌هاي متوالي، ضعيف مي‌شود. همچنين ممكن است اسپاون وارداتي نامرغوب باشد، لذا توليد اسپاون مرغوب در داخل كشور، امري ضروري است. در همين راستا از حدود هفت سال پيش، تحقيقات در زمينه توليد اسپاون هيبريد، در دانشكده كشاورزي (گروه بيوتكنولوژي) دانشگاه فردوسي مشهد، آغاز شده است. 

تاريخچه پرورش قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد: 
كشت قارچ تكمه‌اي سفيد، در قرن هفدهم ميلادي در حومه پاريس بوسيله باغبانان فرانسوي در هواي آزاد، صورت گرفت، با كشف اين نكته، كه وجود نور براي رشد اين قارچ، ضروري نيست و در تاريكي هم مي‌توانند رشد نمايند. در اوايل قرن نوزدهم كشت و پرورش قارچ، در غارهاي طبيعي، معادن و تونلهاي حفر شده در فرانسه، توسعه زيادي پيدا كرد. كشت و پرورش قارچ، در اوايل نيمه دوم قرن 19 از اروپا به ايالات متحده امريكا سرايت كرد و در سال 1890، مزرعه‌داران ايالت پنسيلوانياي امريكا، به پرورش قارچ در فضاهاي سرپوشيده اشتغال ورزيدند. اين كار به سرعت در ساير مناطق رايج شده و متعاقب آن سالنهاي ويژه‌اي براي پرورش قارچ خوراكي احداث شد 
(سينگر و هريس، 1987)  .
با گسترش علم زيست‌شناسي و اختراع و پيشرفت ميكروسكوپ و روشهاي ميكروبيولوژيكي كاشت و پرورش قارچهاي خوراكي، توجه دانشمندان به اين موضوع بيشتر جلب شد. در سال 1884 دانشمنداني از جمله مارچوت و كنستانتين، موفق به توليد اسپاون استريل، توسط جوانه زني توده اسپورهاي اين قارچ، در شرايط آزمايشگاهي شدند. در سال 1905 داگر موفق به تهيه اسپاون قارچ تكمه‌اي گرديد و مطالعات خود را براي تهيه بذر خالص قارچ، از كشت بافت منتشر كرد و بدين ترتيب اولين گام در اصلاح قارچ تكمه‌اي، برداشته شد. از سال 1910 به بعد، كشت و توليد اين قارچ در گلخانه‌ و محيط‌هاي كنترل شده رواج پيدا كرد. در سال 1920، كشاورزان اروپايي، به علت تغيير وسائل نقليه از اسب به ماشين، به فكر تهيه كمپوست از منابع جديد، (كاه و كلش و كود مرغ) به جاي كمپوست اسبي افتادند. لامبرت از ايالات متحده امريكا، اساس تكنولوژي نوين امروزي پرورش قارچ خوراكي را، بنيان نهاد. وي در سال 1932 تهيه بذر قارچ بر روي غلات را ابداع نمود (لامبرت، 1932). انقلاب صنعتي كه سيندر طي سالهاي 1938 تا 1946 در تهيه كمپوست مصنوعي، براي صنعت پرورش قارچهاي خوراكي بوجود آورد، در واقع، دومين قدم در اصلاح اين قارچ بوده است (سيندر، 1938) . بنا به گزارش پاتاك و همكاران، از دهه 1960، توسعه توليد و پرورش قارچ خوراكي بويژه تكمه‌اي سفيد، به شيوة مدرن، در اكثر كشورها، بويژه در ايالات متحده امريكا آغاز گرديد (پاتاك و همكاران، 1960) . در اواخر دهه 1970 و اوايل دهه 1980 فريش، طي يك برنامه اصلاحي بلندمدت، موفق به گزينش و معرفي نژادهاي U1 و U3 گرديد، كه نقطه عطفي در اصلاح قارچ مذكور است (فريش، 1983) . 
در ايران، از سال 1376 نخستين گامهاي اصلاحي، براي بهبود نژادي قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، در دانشكده كشاورزي مشهد برداشته شده است. طي سالهاي 79ـ1377 نخستين فرايند اصلاحي با بهينه‌سازي شرايط كشت تك اسپور، آغاز شد (گردان، 1379). در سال‌هاي 82ـ1380 با بهينه سازي شناخت هموكاريونها، با استفاده از نشانگر ملكولي RAPD گامي مؤثر، در جهت تسريع فرايند اصلاحي قارچ تكمه‌اي سفيد، برداشته شد (كاووسي، 1382).
در سالهاي 83ـ1381 شاخصه‌هاي اصلاحي بر عملكرد قارچ خوراكي تكه‌‌اي سفيد، مورد بررسي قرار گرفت (خاتمي، 1383). در اين تحقيق كه از سال 1382 آغاز شده است، به بررسي قابليت تركيب پذيري عمومي و خصوصي در ده ايزوله خالص هموكاريون پرداخته شده است، تا در نهايت بتوانيم بهترين ايزوله هموكاريون براي تركيب با ساير هموكاريونها را بشناسيم و همچنين، از بين تمامي تلاقي‌هاي دو به دو بدست آمده، بهترين دورگ با بيشترين عملكرد را، معرفي كنيم. اميد است، نتايج حاصل از اين تحقيق گامي در جهت پيشبرد اصلاح اين قارچ، باشد.
 
آشنايي اجمالي با قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد:
قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد با نام علمي Agaricus bisporus و نام انگليسي
 The White Button Mushroom شناخته مي‌شود.
طبقه‌بندي:
كليه موجوداتي كه قارچ ناميده مي‌شوند، در سه سلسله جداگانه قرار مي‌گيرند 
(جان و همكاران، 1996) .
1ـ سلسله Fungi            2ـ سلسله Stramenopila         3ـ سلسله Protista
قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، يك قارچ عالي، متعلق به سلسله Fungi است.
رده بندي: 
سلسله: Fungi             
شاخه: Basidiomycota         
رده: Hymenomycete         
راسته: Agaricale        
خانواده: Agaricacea            
جنس: Agaricus      
گونه:Bisporus 
قارچها، فاقد كلروفيل هستند و براي بقاء خود، متكي به وجود مواد آلي هستند، يعني به اصطلاح، هترو تروف  مي‌باشند.
چنانچه مواد آلي مورد نياز قارچها فقط از گياهان  مرده جذب گردد، به آنها، گندرو  مي‌گويند. قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد فقط از بقاياي گياهان تغذيه مي‌كند، بنابراين يك قارچ گندرو مي‌باشد (جان و همكاران، 1996) .
اصطلاح Mushroom به اندام گوشتي توليد كننده اسپور قارچها، اطلاق مي‌شود و مي‌توان گفت كه ماشرومها خوراكي  يا سمي  هستند. در شاخه Basidiomycota قارچهاي خوراكي جنس Agaricus، Pleurotus، Volvariella و Lentinus بيشتر مورد توجه هستند.

اندام شناسي قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد: 
اصطلاح تكمه‌اي از شكل ظاهري اين قارچ در هنگام جواني، گرفته شده است. هرچند كه اين مرحله ناپايدار است و قارچ در مرحله بلوغ، به حالتي چتري در مي‌آيد. به طور كلي يك قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، از دو قسمت عمده تشكيل شده است. قسمت چتري كه به صورت كلاهك  پهن است و قسمت دوم، پايه  كه كلاهك را نگه مي‌دارد (گوپتا، 1988) . پايه قارچ دو وظيفه را عهده‌دار است. اولاً، كاملاً توپر است تا بتواند كلاهك را، محكم نگه دارد. ثانياً، كلاهك قارچ را، از سطح زمين بالا برده، به طوريكه اسپورها شانس مناسبي براي قرارگرفتن در جريان هوا داشته باشند و موقعيت مناسب و مؤثري براي پراكنده شدن اسپورها، ايجاد سازد (اينگلد، 1996) .
اسپورها بر روي تيغه‌ها قرار دارند و تيغه‌ها در سطح زيرين كلاهك جاي دارند. در هنگام جواني، كلاهك قارچ توسط يك غشاء  كه بين كلاهك و پايه تشكيل مي‌شود پوشيده شده است اين غشاء پس از پاره شدن، اطراف پايه را فرا مي‌گيرد كه حلقه  ناميده مي‌شود. در قارچ A.bisporus ، كلاهك به رنگ سفيد، كرم يا قهوه‌اي رنگ و تقريباً صاف و نرم و در بعضي موارد، داراي پولك‌هاي كوچك است. سطح كلاهك در اين قارچ، محدب است كه در نهايت كاملاً پهن و گوشتي مي‌شود. پايه به صورت مركزي، سفيد و استوانه‌اي و محكم است كه در قسمت تحتاني آن ضخيم‌تر بوده و به تدريج كه به سمت بالا مي‌آيد باريك‌تر مي‌شود. وسيله تكثير اين قارچ، اسپور است كه در حقيقت، همان بازيديوسپورها  هستند. بازيديوسپورها در سطح خارجي تيغه‌هاي  كلاهك به صورت يك لايه به نام هيمينيوم  تشكيل مي‌شوند. بازيديومها سلولهايي هستند كه، بازيديوسپورها بر روي آنها قرار دارند (جندرز، 1982) 

مشخصات پرگنه در كشت خالص: 
پرگنه يا كلني ، تودة ميسليومي رشد يافته است و مي‌توان، آن را در محيط كشت غذايي به اشكال مختلف رشته‌اي، پنبه‌اي، نمدي و بدون ميسليوم هوايي مشاهده نمود. ميسليوم‌ها ضمن رشد انتهايي، انشعابات متعدد نيز توليد مي‌كنند، كه مطلوب‌ترين شكل رشد ميسليوم‌ها به صورت رشته‌اي و داراي ميسليوم هوايي است، كه اين موضوع در عملكرد قارچ حائز اهميت است (لامبرت و همكاران، 1983)  مشاهده شده است كه برخي از نژادهاي اين قارچ، پرگنه خاكستري مايل به سفيد و ميسليوم هوايي كمتري توليد مي‌كنند و گروهي ديگر، ميسليوم هوايي زياد توليد كرده و شكل پنبه‌اي به خود مي‌گيرند (كليگمن، 1943) 

نامگذاري علمي قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد:
اين قارچ در منابع مختلف به نامهاي متعددي ذكر شده است در اولين كتبي كه در مورد پرورش اين قارچ منتشر شده، از اين قارچ به نام Psalliota campestis نام برده شده است. البته اين نام به علت نداشتن اساس تاكسونوميكي مورد پذيرش قرار نگرفته است. 
در سال 1945 در كنگره بين‌المللي گياهشناسي پاريس، نام علمي قارچ تكمه‌اي سفيد A.bisporus (Lange) Impach انتخاب شد (سينگر و هريس، 1987)  ولي نام A.bisporus متداول‌تر است. نام‌ معادل ديگر اين قارچ peck A.brunnescens است. (بارتون، 1988) 
 
تقسيم‌بندي واحدهاي سلولي ميسليوم از لحاظ تعداد و تركيب‌بندي هسته‌اي: 
هموكاريون : به معناي جورهسته‌اي بودن است و به ميسليوم‌هايي كه هسته‌هايي از يك ژنوتيپ منفرد دارند، گفته مي‌شود. سلولهاي ميسليوم در هموكاريون‌ها يا چندهسته‌اي هستند يا تك هسته‌اند كه در حالت تك هسته‌اي، به آن مونوكاريون گفته مي‌شود. در قارچ تكمه‌اي سفيد، هموكاريون‌ها در هر واحد سلولي، چند هسته دارند ولي در اكثر قارچ‌هاي خوراكي ديگر، سلول‌ها حاوي يك هسته‌اند. 
هتروكاريون : به معناي ناجور هسته‌اي بودن است و به ميسليومهايي كه داراي هسته‌هايي با دو يا چند ژنوتيپ متفاوت و سازگار هستند، گفته مي‌شود. اين ميسليوم‌ها قادر به توليد اندام باردهي هستند (سينگر و هريس، 1987).
داي كاريون : هنگامي كه دو هيف ناشي از دو مونوكاريون، با تيپ آميزشي متفاوت، تلاقي مي‌يابند، ميسليومي بوجود مي‌آيد كه سلولهاي آن هر كدام دو هسته متفاوت و سازگار دارند. به اين ميسليوم كه نوعي هتروكاريون است، داي‌كاريون گفته مي‌شود. (سينگر و هريس، 1987) 

چرخه زندگي قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد: 
چنانچه بازيديوسپورها در شرايط مناسب قرار گيرند تندش (جوانه زني) كرده و از آنها رشته‌هاي نازكي خارج مي‌شود، كه هيف نام دارد. اين هيفها به سرعت رشد كرده و داراي ديواره عرضي مي‌شوند و توليد يك شبكه هيفي به نام ميسليوم مي‌كنند. اين قسمت، اندام رويشي قارچ را تشكيل مي‌دهد. در شرايط مناسب قارچ وارد دورة جنسي مي‌شود و توليد بازيديوكارپ مي‌كند بازيديوكارپ، همان اندام خوراكي قارچ را شامل مي‌شود. هنگامي كه قارچ به مرحلة بلوغ رسيد، پرده بين كلاهك و پايه كه قبلاً قسمت زير كلاهك را پوشانده است، پاره شده و كلاهك پهن مي‌شود. سپس زمانيكه كلاهك قارچ به بلوغ رسيد، تيغه‌ها نيز در آن تشكيل مي‌شوند. تيغه‌ها در ابتدا به صورت كم رنگ هستند كه به تدريج به رنگ قهوه‌اي شكلاتي در مي‌آيند. اين پديده به وسيلة تعداد زيادي بازيديوسپور قهوه‌اي رنگ كه برروي بازيديوم‌ها ساخته مي‌شوند ايجاد مي‌گردد. بازيديوسپورهاي قارچ A.bisporus بسيار كوچك (قطر 9ـ8 ميكرون) و خيلي سبك هستند شكل آنها عموماً بيضوي است. بازيديومها، سلولهايي هستند كه بازيديوسپورها بر روي آنها قرار مي‌گيرند. هر بازيديوم داراي دو اندام خار مانند به نام استريگما است كه در انتهاي هر يك از آنها يك بازيديوسپور بوجود مي‌آيد (سوننبرگ، 2000).  
در ميسليوم رويشي، هر سلول چند هسته‌ دارد و هسته‌ها هاپلوئيد هستند. در زمان توليد اسپور دو هستة متفاوت از نظر تيپ آميزشي ولي سازگار در سلولهاي انتهاي هيمينيوم، از ساير هسته‌ها جدا مي‌شوند اين دو هسته به هم ملحق شده و توليد يك مرحلة ديپلوئيد ناپايدار مي‌كنند سپس وقوع ميوز، منجر به توليد چهار هسته مي‌شود در بازيديوم‌هايي كه چهار اسپور توليد مي‌كنند، يك هستة ميوزي هاپلوئيد به درون هر اسپور وارد مي‌شود، اما در بازيديوم‌هايي كه دو اسپور توليد مي‌كنند، دو هستة ميوزي هاپلوئيد به هر اسپور مهاجرت مي‌كنند، كه اگر اسپور توليد شده داراي دو هسته با تيپ آميزشي مشابه باشد ميسليوم حاصل از تندش آن اسپور، عقيم خواهد بود (ايوانز، 1959).  
 
در قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد اغلب بازيديوسپورها حاوي دو هسته هاپلوئيد هستند(پاندي و همكاران، 1994). 
 
 بررسي الگوهاي چرخه زندگي در A.bisporus
هموتاليسـم: 
حدود 10 درصد از قارچهاي خوراكي، هموتال هستند. در اين قارچها، هيف ناشي از يك اسپور قادر است كه توليد اندام باردهي كند و به اصطلاح، خود بارور است. هموتاليسم خود بر دو نوع است:
الف)هموتاليسم اوليه: در اينجا يك هيف ناشي از يك اسپور قادر است كه دستخوش يك مرحله ناجور هسته‌اي شدن شود و لذا چرخه جنسي آن كامل مي‌شود، مثل volvariella volvacea (پاندي و تو‌اري، 1994). 
ب)هموتاليسم ثانويه: در اين سيستم، يك اسپور كه خود حاوي دو هسته با تيپ آميزشي متفاوت است مي‌تواند توليد يك هيف كند و در نهايت اندامهاي باردهي بوجود آيد. اين سيستم به هموتاليسم كاذب Pseudo homothallism نيز ناميده مي‌شود، مثل A.bisporus 
(ايمبرنون و همكاران، 1996) 
 
هتروتاليسـم: 
حدود 90 درصد از قارچهاي خوراكي هتروتال هستند اين قارچها خود عقيمند و هيف ناشي از يك اسپور، قادر به توليد اندام باردهي نيست. در اين قارچها تلاقي دو هيف ناشي از دو اسپور داراي هسته‌هايي متفاوت از نظر تيپ آميزشي، براي تكميل چرخه جنسي لازم است
(پاندي و همكاران، 1994).
ميلر در سال 1971 نظريه هموتاليك ثانويه را براي قارچ A.bisporus ارائه داد. اما چرخه زندگي قارچ تكمه‌اي سفيد تنها به صورت هموتاليك ثانويه نيست، بلكه درصد اندكي نيز هتروتاليسم مي‌باشند، به طوريكه به ميزان اندكي نيز بازيديوم‌هاي 3 تا 4 اسپوره توليد مي‌شود كه هاپلوئيد (n) هستند و عقيم بوده، ميوه نمي‌دهند، يا اندك باردهي دارند. قارچهايي را كه داراي هر دو نوع اسپور هتروتال و هموتال ثانويه هستند، آمفي تاليسم نامند (زو و همكاران، 1993). 


 
 
ژنتيك قارچ A.bisporus:
در حالت هموتاليك ثانويه، وقتي دو هستة ميوزي هاپلوئيد، كه از نظر تيپ آميزشي متفاوت هستند، وارديك بازيديوسپور مي‌شوند، اين بازيديوسپور هيفي را توليد مي‌كند، كه خود بارور است. وضعيت عمومي آن است كه هر كدام از بازيديومها فقط دو بازيديوسپور توليد كند. در حالي كه در قارچ A.bisporus يك ژن با دو آلل وضعيت هتروكاريوتيكي را كنترل مي‌كند (اليوت‌، 1972).  مي‌توان در يك بازيديوسپور آلل آميزشي يك هسته را به نام Ax و آلل آميزشي هستة ديگر را    ناميد. اين دو هسته با هم تركيب شده و يا يك تقسيم ميوز، چهار هسته توليد مي‌شود. اگر چهار هسته حاصل از تقسيم ميوز را با نام‌هاي   بناميم، اسپورهاي توليد شده به صورت   خواهند بود. بازيديوسپورهايي كه داراي هر دو آلل   و   هستند، ميسليوم بارور توليد مي‌كنند و بازيديوسپور‌هايي كه آلل‌هاي مشابهي از   يا   دارند، ميسليوم خود عقيم توليد مي‌كنند. بنابراين 67/66 درصد از اسپورها، خود بارور و 33/33 درصد آنها، خود عقيم‌اند. اما وضعيت ديگر آن است كه از هر بازيديوم‌‌، 3 يا 4 استريگما و متعاقباً 3 يا 4 اسپور توليد مي‌شود، كه اسپورها هر كدام يك هسته ميوزي دارند و خود عقيم‌اند. توضيح اين كه حالات فوق كاملاً تصادفي اتفاق مي‌افتد و نسبت‌هاي فوق تغيير خواهد كرد. 
در 75% گونه‌ها هتروتاليك، سازگاري آميزشي توسط دو سري فاكتور خود ناسازگاري، يعني فاكتورهاي A و B كنترل مي‌شود و فاكتورهاي A و B به طور مستقل در ميوز، جور و تفكيك مي‌شوند. در اين سيستم، دو لوكوس تيپ آميزشي، مجزا وجود دارد كه براي توليد يك ميسليوم داي‌كاريون، در هر اسپور بايد الل‌هاي مختلفي وجود داشته باشد. در اين سيستم چهار تيپ مجزا از 
اسپورها بر روي هر بازيديوم توليد مي‌شود و هر اسپور تصادفي از يك نژاد منفرد، فقط با يك چهارم از ديگر اسپورها، سازگار مي‌باشد (پاندي و همكاران، 1993). 

 
در ميان قارچ‌هاي خوراكي، كار اصلاحي بر روي قارچ A.bisporus   از همه مشكل‌تر است. در حقيقت مشكلات اصلاحي اين قارچ به زيست شناسي خاص آن برمي‌گردد. تا قبل از سال 1970 ميلادي، اطلاعات نسبتاً كمي از زيست شناسي قارچ تكمه‌اي سفيد در دست بود، لذا تا قبل از سال 1970 كار اصلاحي بر روي آن، براساس گزينش تصادفي بود. 
در سال 1971 ميلادي ميلر و همكاران ثابت كردند كه اين قارچ در طي چرخه زندگي خود، وضعيت هموتاليك ثانويه دارد. طبق اين وضعيت در قارچ تكمه‌اي سفيد، سلولهاي ميسليوم چندهسته اي هستند(ميلر و همكاران، 1971). 
در سال 1972 ميلادي ريپر و همكاران نظرية ميلر را با استفاده از نشانگرهاي اگزوتروفيك، ثابت كردند(ريپر و همكاران، 1972).  اليوت و همكاران در 1973 نظريه ميلر را با استفاده از آناليز تتراد ثابت كردند (اليوت و همكاران، 1973). 

فيشر و همكاران در سال 1978 ميلادي توليد نژادهاي   را آغاز كردند، كه نقطة عطفي در به نژادي قارچ خوراكي سفيد بود. در سال 1989 چنگ و همكاران گزارش كردند كه در قارچ تكمه‌اي سفيد تندش بازيديوسپورها بسيار ضعيف و ناهماهنگ است (چنگ و همكاران، 1989).  در سال 1993 ميلادي كريگان و همكاران موفق به ترسيم نقشه ژنتيكي اين قارچ با استفاده از نشانگرهاي مولكولي شدند( كريگان و همكاران، 1993). اين قارچ داراي 13 عدد كروموزوم در هر هستة هاپلوئيدي خود است (13= n )طبق گزارش هورگن و همكاران در سال 1993 ميلادي، مانع اصلي اصلاح اين قارچ، فقدان يك بازيديوسپور تك هسته‌اي در خلال چرخه زندگي اين قارچ است(هورگن و همكاران، 1993).  در قارچ تكمه‌اي سفيد غالباً، هر بازيديوسپور دو هسته‌ هاپلوئيد متفاوت از نظر تيپ آميزشي (هتروكاريون) دارد و توليد بازيديوسپور تكه هسته‌اي، كه ناشي از بازيديومهاي 3 يا 4 اسپوري است، بسيار كم است (حدود 10 درصد). اين بازيديوسپورها، ميوه نمي‌دهند يا اينكه اندام باردهي بسيار كمي توليد مي‌كنند(كريگان و راس، 1987).  كشتهاي تك اسپور حاصل از اين نوع اسپورها، ميسليوم رويشي توليد مي‌كنند كه داراي تعدادي هسته با تيپ آميزشي يكسان هستند. اين نوع مسيليوم  رويشي، هموكاريون ناميده مي‌شود كه مي‌تواند با ميسليوم هموكاريون ديگري كه تيپ آميزشي متفاوت ولي سازگار دارد، جهت تشكيل ميسليوم هتروكاريون، تلاقي انجام دهد. 



روشهاي بهبود نژادي در قارچ A.bisporus:

1ـ وارد كردن نژادهاي مرغوب: وارد كردن نژادهاي مرغوب از كشورهاي ديگر، يكي از راههاي مستقيم اصلاح قارچ تكمه‌اي سفيد است. 

2ـ جمع‌آوري ژرم پلاسمهاي وحشي: برخي كشورها از نظر منابع قارچ‌هاي خوراكي و از جمله قارچ    A.bisporus غني هستند. برخي از اين قارچهاي وحشي مي‌توانند ژن يا ژن‌هاي مقاومت به يك يا چند بيماري را به نژادهاي موجود انتقال دهند (مهتا و همكاران، 1993).  بوهوس و همكاران در سال 1953 ميلادي در مجارستان، آزمايشي را با چند نژاد وحشي قارچ خوراكي در مقياس بزرگ انجام دادند و مشاهده كردند كه نژادهاي وحشي داراي تنوع بالايي از لحاظ ميزان رشد، تناوب زمان باردهي و كيفيت قارچ هستند. 

3ـ گزينش درون نژادي: از سه طريق مي‌توان به اين امر دست يافت: كشت بافت، كشت تك اسپوري، كشت چند اسپوري. 

4ـ دورگ‌گيري: هدف از دورگ‌‌گيري، گرد هم آوردن شاخص‌هاي مطلوب ژنتيكي از نژادهاي مختلف و توليد يك ژرم پلاسم جديد است. 

5ـ تلاقي هدفمند هموكاريون‌ها: 

6ـ مهندسي ژنتيك: 



كشت بافت: 

اولين گزارشات در مورد كشت بافت به دهة 1940 ميلادي باز مي‌گردد كه كليگمن استفاده از كشت بافت قارچ‌هايي با ظاهر و مرفولوژي مطلوب را به دليل داشتن ميوه‌دهي و عملكرد بالا پيشنهاد كرد (كليگمن‌، 1940).  مهتا و همكاران در سال 1994 گزارش كردند كه كشت بافت از كلاهك يا پايه قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد گرفته مي‌شود. براي انجام كشت بافت از كلاهك تازه، ابتدا كلاهك با استفاده از هيپوكلريت سديم يك درصد، به مدت پنج دقيقه ضدعفوني مي‌شود سپس نمونه‌هايي از قسمتهاي دروني بافت كلاهك انتخاب و به محيط كشت منتقل مي‌شود. نگهداري كشت‌ها در دماي   درجه سانتيگراد صورت مي‌گيرد. پس از چند روز، ميسليوم‌ها در سطح محيط كشت ديده مي‌شوند. 

 

گزينش از طريق كشت تك اسپوري: 

ابتدا، نحوه بدست آورن اسپور از قارچ تكمه‌اي سفيد توضيح داده مي‌شود و سپس نحوه كشت تك اسپور، شرح داده خواهد شد. 



تهيه نقش اسپور: 

طبق گزارش رويز و همكاران در سال 1982 ميلادي كلاهك جواني كه پرده زير آن كشيده شده است، اما هنور باز نشده است، انتخاب و تميز مي‌شود. سپس پايه زير كلاهك را جدا كرده و كلاهك در يك بشر سترون شده (استريل) كه حاوي يك كاغذ صافي است، قرار داده مي‌شود. پس از حدود 72 ساعت، كاغذ صافي كه حاوي اسپور است، را به نوارهايي تقسيم مي‌كنند و اين نوارها را در لوله‌هاي پلاستيكي 5 ميلي ليتري در يخچال نگهداري مي‌كنند. همچنين نقش اسپور در روي كاغذ صافي را مي‌توان در يخچال براي استفاده بعدي، نگهداري كرد(رويز و همكاران، 1982). 



الف ـ كشت و گزينش تك اسپوري: 

هورگن و همكاران در 1989 ميلادي گزارش كردند كه تندش بازيديوسپورهاي قارچ A.bisporus با مشكل كندي تندش و همچنين متغير بودن فرايند تندش و آلودگي روبرو است (هورگن و همكاران، 1989).  آنها ابتدا تراكم اسپور در مايع تعليقي تهيه شده را با استفاده از يك هموسايتومتر براي تراكم اسپور 100 هزار در ميلي‌ليتر تنظيم كردند. سپس 20 هزار اسپور در داخل هر ظرف پتري حاوي محيط غذايي PDA (Popato Dexterose Agar) قرار داده شد براي تحريك تندش بازيديوسپورها، در يك طرف پتري قطعه‌اي از ميسليوم قارچ A.bisporus قرار داده مي‌شود. بعد از 14ـ3 روز، تك اسپورهاي تندش كرده را جدا كرده و به محيط كشت جديد منتقل كردند. تك اسپورها از نظر سرعت رشد، شكل اندام توليدمثلي، باروري و عملكرد تنوع داشتند. با استفاده از اين شيوه، نژادهاي تجاري بسياري با عملكرد قابل قبول توليد شده است. در مركز ملي تحقيقات قارچ خوراكي در هند، تك اسپورهاي زيادي از نژادهاي مختلف جدا شده است. اين تك اسپورها براساس شاخص‌هاي رشد ميسليومي، نحوة رويش اسپاون در بستر كشت، عملكرد و شاخص‌هاي اندام باردهي گزينش شده‌اند ميسليوم‌هايي كه به صورت رشته‌اي رشد كرده‌اند، گزينش شده‌اند، و از ‌آنها اسپاون تهيه مي‌شود. سپس آزمايشات ميوه‌دهي در حجم كم انجام مي‌شود و در نهايت آزمايشات ميوه‌دهي تكرار دار، در حجم بزرگ، براي ارزيابي دقيق تك اسپورها صورت مي‌گيرد 

(پاتاك و همكاران، 1998). 





ب ـ كشت و گزينش چنداسپوري: 

مهتا و همكاران در 1994 ميلادي گزارش كردند كه گزينش چند اسپوري، يكي از قديمي‌ترين و راحترين روشهاي گزينش براي قارچ A.bisporus بوده است (مهتا و همكاران، 1994).  كشت چند اسپوري مشابه با كشت تك اسپوري است. طبق گزارش پاتاك و همكاران در سال 1998 مي‌توان از تراكم‌هاي بين 50 هزار تا 200 هزار اسپور در هر ميلي‌ليتر استفاده كرد و براي هر پتري 20 هزار اسپور در نظر گرفت. اسپورها از روز سوم شروع به تندش مي‌كنند و ساير مراحل كشت چند اسپوري، مشابه با كشت تك اسپوري است. از يك هفته بعد از كشت چند اسپوري، گزينش را براساس همان معيارهايي كه در كشت تك اسپوري توضيح داده شد، انجام مي‌گيرد. 

هنگامي كه هدف از گزينش، بازيابي عملكرد يك نژاد مشخص است، گزينش با استفاده از كشت تك اسپوري و چند اسپوري سودمند است. پس اين روشها فقها باعث كشف و حفظ نوتركيبي‌ها درون يك نژاد مي‌شوند و لذا براي رسيدن به يك نژاد با شاخصهاي ژنتيكي مطلوب و در نهايت با عملكرد بالا، بايد از روشهايي كه بعداً اشاره مي‌شود استفاده كرد و روشهاي گزينش تك اسپور و چند اسپوري تا حدودي تنوع درون يك نژاد را نشان مي‌دهند.



اختلاط ساده:  

بنا به گزارش پاتاك و همكاران در سال 1998 ميلادي، دو نژاد بارور از كشت تك اسپور يا چند اسپوري تهيه مي‌شود اين دو نژاد، همزمان در يك پتري حاوي محيط كشت مناسب قرار داده مي‌شود. ميسليوم اين دو نژاد در سطح محيط كشت به طرف يكديگر رشد مي‌كنند سپس از محل پيوند هيفها، نمونه‌هايي برداشته و به محيط كشت جديد، منتقل مي‌شود. در مرحله بعدي، از اين اختلاط ساده، اسپاون تهيه شده است و مراحل گزينش بر روي آن صورت مي‌گيرد. اختلاط ساده نژادها براي توليد دورگ، از آسانترين روش‌ها در برنامه‌هاي اصلاحي به شمار مي‌رود. در اين گزارش، دو نژاد متفاوت از لحاظ رنگ كلاهك و مرفولوژي اندام باردهي، براي اختلاط ساده، استفاده شده‌اند. در نهايت، اندام‌هاي باردهي جديد و نوتركيب بدست آمد و صفت رنگ كلاهك به وسيلة جدا كردن تك اسپورها، حفظ شد. در مركز ملي تحقيقات قارچ خوراكي در هند، هيف حاصل از اختلاط ساده پنج نژاد متفاوت، هيچ تفاوت معني‌داري با والدينش نشان نداد و بنابراين هيفهاي جديد به آساني به عنوان هيبريد نمي‌توانستند در نظر گرفته شوند. مي‌توان گفت، روش اختلاط ساده، يك روش تصادفي و غيرقابل پيش‌بيني براي بدست آوردن دو رگ با عملكرد بالا است. 



تلاقي هدفمند هموكاريون‌ها: 

يكي از راههاي اساسي اصلاح قارچ A.bisporus، بدست آوردن هموكاريونها و تلاقي آنها و سپس گزينش و انتخاب آنها بر طبق يك برنامه اصلاحي و براساس يكسري شاخصه‌ها مي‌باشد. در اين روش، صفات مطلوب نژادهاي متفاوت در يك نژاد جديد، جمع مي‌شوند. مسأله اصلي در اين روش، وجود خاصيت هموتاليك ثانويه در قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد است. در اين نوع برنامه اصلاحي، گام اول بدست آوردن هموكاريون‌ها است، يعني بدست آوردن تك اسپورهايي كه داراي يك هسته ميوزي‌اند و ميسليوم عقيم توليد مي‌كنند. در زمان تلاقي اين ميسليوم‌هاي عقيم، نتايج هتروكاريون و بارور مي‌شوند. 



بدست آوردن هموكاريونها و تأييد آنها: 

1ـ روش سنتي تأييد هموكاريونها:

جدا كردن تك اسپورهايي كه داراي يك هسته هاپلوئيدي مي‌باشند، كار آزمايشگاهي بسيار سختي است. علت آن است كه غالب بازيديوسپورهاي قارچ A.bisporus قدرت باردهي دارند و داراي مكان ژني تيپ آميزشي هتروزايگوس مي‌باشند و تنها قسمت اندكي از بازيديوسپورها، سه يا چهار اسپور تك هسته‌اي توليد مي‌كنند (كسل و همكاران، 1988).  بنابراين، تك اسپورهايي كه داراي يك هسته هاپلوئيدي هستند، ميسليوم عقيم توليد مي‌كنند و اندام باردهي ندارند اولين گزارش در مورد بدست آوردن تك اسپورهايي كه عقيم بودند و قدرت توليد اندام باردهي نداشتند توسط سيندر در سال 1937 گزارش شد. بنا به گزارش مهتا و همكاران در سال 1994 با وجود اينكه روش سنتي، زمان زيادي مي‌خواهد، ولي منجر به توليد اسپاون‌هاي هيبريد پر محصول   در سال 1981 در هلند شده است. تنها راه براي تأييد هموكاريون به روش سنتي، آزمون ميوه‌دهي است كه بسيار زمان‌بر است. در اينجا فرض است كه هموكاريون‌ها قدرت توليد اندام باردهي ندارند. البته گاهي ميوه‌دهي، در برخي از هموكاريونها به ميزان بسيار اندك ديده مي‌شود. بنا به گزارش خوش و همكاران در سال 1995 ميلادي متأسفانه هيچ نشانگر فنوتيپي مشخص، براي تمايز ميسليوم‌هاي هموكاريون از هتروكاريون وجود ندارد، ولي مي‌توان گفت كه رشد ميسليوم هموكاريون، بسيار كندتر از رشد ميسليوم هتروكاريون است ولي اين معيار، دقيق نيست زيرا در نمودار توزيع سرعت رشد، هتروكاريونها در تمام كلاسهاي رشدي ديده مي‌شوند (خوش و همكاران، 1995). 



2ـ تهيه و تأييد هموكاريون‌هاي والدي به روش تهيه پروتوپلاست: 

كسل و همكاران در سال 1992 گزارش كردند، موقعي كه از ميسليوم هتروكاريون پروتوپلاست توليد مي‌شود سه وضعيت ممكن است رخ دهد (كسل و  همكاران، 1987). 

الف)بيشتر پروتوپلاست‌هاي تهيه شده از ميسليوم‌هاي جوان و قوي از نظر رشدي، هتروكاريون‌اند و داراي هر دو نوع هسته والدي هستند.

ب)قسمتي از پروتوپلاستها، فاقد سيتوپلاسم لازم يا فاقد تركيبات هسته‌اي براي باززايي هستند،كه اين پروتوپلاستها، بي‌ارزش هستند. 

ج)يك قسمت از پروتوپلاستهاي تهيه شده، هموكاريون خواهند بود كه تنها، يك نوع هسته والدي را دارا هستند، اين نوع پروتوپلاستها در برنامه اصلاحي قارچ A.bisporus بسيار با ارزش هستند (هور‌گن و اندرسون، 1992). 



3ـ تأييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RFLP:

همانطور كه گفته شد، در قارچ خوراكي تكمه‌اي سفيد، اكثر بازيديوسپورها دو هسته غيرخواهري (دو نوع متفاوت) از چهار هستة ميوزي را دريافت مي‌كنند. پس اكثر بازيديوسپورها در مكان ژني، در حال تفرق هتروآلليك هستند. اين امر به ويژه براي اللهاي مشهور به اللهاي تيپ آميزشي، مشاهده شده است كه ميسليوم خود بارور توليد مي‌كنند. تنها درصد كمي از بازيديوسپورها در مكان ژني تيپ آميزشي، هموآلليك هستند و ميسليوم خود عقيم توليد مي‌كنند. كسل و همكاران در 1987 گزارش كرده‌اند كه در آزمايش     RFLP فنوتيپ‌هاي مربوط به هموكاريونهاي والدي، هتروكاريونهاي والدي و تك اسپورهايي كه به عنوان نتايج F1 هتروكاريون گرفته مي‌شوند، در كلاسهاي مختلف فنوتيپي توزيع مي‌شوند. براساس آزمايشي كه بوسيله سامربل و همكاران در سال 1989 صورت گرفت گزارش شده كه از 367 تك اسپور (حاصل از نتايج F1 هتروكاريون) كه مورد بررسي قرار گرفت، 351 اسپور (6/95 درصد) در تمامي مكانهاي ژني RFLP، هتروآلليك بودند. 16 اسپور باقيمانده، متفاوت از والد هتروكاريون بودند كه 10 اسپور از اين تعداد (5/62درصد) در تمام مكانهاي ژني RFLP ، وضعيت هموآلليك نشان دادند. اين اسپورها به احتمال قوي هموكاريونهايي هستند كه از بازيديوسپورهاي تك هسته‌اي گرفته شده‌اند و يا به احتمال ضعيف، هموكاريونهايي‌اند كه در داخل هر اسپور آنها دو هستة خواهري (دو هسته مشابه) وجود دارد. 

5 اسپور فقط در يكي از مكانهاي ژني، حالت هموآلليك نشان دادند و بقيه مكانهاي ژني آنها، هتروآلليك بودند وضعيت اين پنج اسپور نشان داد كه كراسينگ اور، بين مكان ژني نشانگر و سانترومر مربوطه اتفاق افتاده است، در نهايت يك اسپور باقيمانده به زحمت در يكي از كلاسهاي فنوتيپي طبقه‌بندي شد(سامربل و همكاران، 1989). 



4ـ تأييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RAPD:

طبق گزارش خوش و همكاران در سال 1992 مكان‌هاي ژني RAPD، در يكي از والدين تكثير پيدا مي‌كنند و در والد ديگر تكثير نمي‌شوند. اين روش براي شناخت هموكاريون بودن يا هتروكاريون بودن نتايج تك اسپور جدا شده، به كار مي‌رود. از كاربردهاي ديگر اين روش، استفاده از نشانگرهاي RAPD به عنوان نشانگر انتقال مكان‌هاي ژني به تك اسپور نتاج است، در آزمايشي كه بوسيلة خوش و همكاران در سال 1992 انجام شده است، ابتداDNA از تك اسپورها استخراج شد. سپس براي انجام واكنش‌هاي RAPD، از چهار نوع آغازگر اختياري استفاده شد و در اين آزمايش اختلاف بين هشت نژاد هتروكاريون قارچ Abisporus مشخص شد (خوش و همكاران، 1992). 



انجام تلاقي بين هموكاريونها و تأييد هيبريدها: 

طبق گزارش كسل و همكاران در سال 1988 مي‌توان دو نژاد مختلف هموكاريون را به فاصله 2ـ1 سانتيمتر از هم در يك ظرف پتري حاوي محيط كشت غذايي تازه قرار داد. ظرف پتري به مدت دو تا چهار هفته در درجه حرارت   درجه سانتيگراد نگهداري مي‌شود. در اين مدت ميسليوم‌هاي هموكاريون به طرف يكديگر رشد مي‌كنند. سپس از منطقه تلاقي دو هيف، ريز نمونه‌هايي برداشت مي‌شود و به محيط كشت تازه، منتقل مي‌شود. مورفولوژي پرگنه‌هاي بدست آمده از ناحيه تلاقي و پرگنه والدين هموكاريون مقايسه مي‌شود (كسل و همكاران، 1988).  طبق گزارش مهتا و همكاران در 1994 موقعي كه تلاقي انجام مي‌شود، يكي از نشانه‌هاي انجام هيبريد اين است كه دورگ‌ها، توليد ميسليوم‌هاي رشته‌اي و ضخيم مي‌‌كنند. در اينجا فرض شده است كه هر كدام از والدين هموكاريون به تنهايي توليد اندام باردهي نمي‌كنند و در صورت تلاقي موفقيت‌آميز، دو رگ به دست آمده مي‌تواند در آزمون ميوه‌دهي توليد اندام باردهي كند (مهتا و همكاران، 1994). 

طبق گزارشات كسل و همكاران در سال 1988 از 16 تلاقي موفقيت‌آميز با روش RFLP كه قابل شناسايي بودند ساير تلاقي‌ها كه با شكست روبرو شدند، الگوي باندي يكي از والدين را نشان مي‌دادند. همچنين طبق آزمايشي كه توسط خوش و همكاران در سال 1992 صورت گرفت، هيبريدي حاصل از تلاقي دو هموكاريون   مورد سنجش قرار گرفت. نتايج تك اسپور هيبريد حاصله هنگامي كه توليد اندام باردهي كرد، مورد ارزيابي RAPD قرار گرفت. نتايج تك اسپور جدا شده در محيط كشت‌، تندش كرده‌ و رشد آنها از حالت خيلي سريع تا خيلي كند درجه‌بندي شد. سپس از تك‌اسپور‌هاي جدا شده، استخراج DNA شد و براي واكنشهاي RAPD مورد استفاده قرار گرفت. براساس ژنوتيپ‌هاي دوهموكاريون والدي، مشخص شد كه سيزده مكان ژني هتروآلليك، در هيبريد وجود دارد. 

در اين آزمايش، پنج تك اسپور رشد كند داشتند كه به احتمال قوي باريديوسپورهايي با يك هسته هاپلوئيدي يا بازيديوسپورهايي با دو هستة خواهري داشته‌اند. اسپورهايي كه تمام باندها را نشان دادند، به احتمال قوي، هتروكاريونهايي با دو هسته غيرخواهري مي‌باشند.  كالو‌و ـ بادو نيز  در سال 2000 از نشانگر‌ RAPD جهت تأييد‌ تشكيل هترو‌كاريون‌، بين جدايه‌هاي تك‌اسپور استفاده نمود. وي مشاهده كرد كه DNA هترو‌كاريوني، داراي باند‌هاي مشترك هر دو همو‌كاريون بوده ونيز داراي باند‌هاي اختصاصي همو‌كاريون ويژه هستند و يا اينكه فاقد باند‌هاي رايج در هر دو همو‌كاريون مي‌باشند. بنابراين برخي فرآورده‌هاي RAPD موجود در اجزاء همو‌كاريوني، در طي تشكيل هترو‌كاريون از دست رفته‌اند و فقدان باند‌ها نشان‌دهندة تشكيل هترو‌كاريون است

(كالوو ـ بادو و همكاران، 2000). 



الف‌ـ استفاده از نشانگرهاي غذايي براي تأييد هيبريدها: 

نشانگرهاي غذايي براساس نيازمنديهاي رشدي، نظير اسيدهاي آمينه ويژه، ويتامين‌ها و غيره تعيين مي‌شوند. يك هيبريد مي‌تواند از دو